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磁珠法提取全血gDNA的流程是怎樣的呢

2025-12-18 [35]

磁珠法提取全血gDNA的流程主要分為裂解、結合、洗滌、洗脫四個核心步驟,具體操作及原理如下:

一、裂解

  • 操作:取200μL全血樣品,加入200μL裂解液(含GuHCl/SDS)和10μL蛋白酶K,充分混勻后于55°C水浴10分鐘。

  • 原理:裂解液中的GuHCl和SDS能夠破壞細胞膜和核膜,使gDNA從細胞中釋放出來。同時,加入RNA酶A(10μg/mL)可去除RNA干擾,確保提取的gDNA純度。

二、結合

  • 操作:加入300μL結合緩沖液和20μL磁珠(使用前顛倒或吹吸混勻),顛倒混勻10分鐘。將離心管置于磁力架上1分鐘,使磁珠被吸附,移走管內液體。

  • 原理:調節pH至5.0-6.5(羧基磁珠最佳結合條件),創造高鹽環境,屏蔽DNA磷酸基團的負電荷,促進其與磁珠表面官能團(如羧基、氨基等)的結合。磁珠表面修飾的官能團通過靜電作用或共價鍵與DNA的磷酸骨架結合,實現特異性吸附。

三、洗滌

  • 操作:加入500μL洗滌緩沖液Ⅰ,顛倒混勻數次后利用磁力架吸附磁珠,1分鐘后移走管內液體。重復上述步驟,依次使用洗滌緩沖液Ⅱ和洗滌緩沖液Ⅲ進行洗滌。

  • 原理:使用70%乙醇等洗滌液去除鹽分和雜質(如蛋白質、多糖等)。通過多次洗滌,確保磁珠表面清潔,提高gDNA的純度。

四、洗脫

  • 操作:加入50-100μL洗脫緩沖液(如TE緩沖液,pH 8.0),使磁珠重新懸浮,55°C水浴10分鐘,其間輕輕晃動使DNA充分洗脫。將離心管置于磁力架1分鐘,使磁珠被吸附,將液體轉移至新的離心管中,得到純化的DNA產物。

  • 原理:使用低鹽緩沖液(如TE緩沖液)改變環境,破壞靜電和氫鍵作用,使DNA從磁珠上解吸附下來。通過加熱和輕輕晃動,促進DNA的洗脫效率。

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